Μελέτη ενζύμων του μεταβολισμού των υδατανθράκων που σχετίζονται με την παθοφυσιολογία του Διαβήτη με έμφαση στην DPP-4 και PTP1b και της δυνατότητας εύρεσης ειδικών αναστολέων με πιθανή εφαρμογή στη θεραπεία και τη διαγνωστική.

Abstract

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης (ΣΔ) είναι μια πολυπαραγοντική μεταβολική νόσος, με κύριο χαρακτηριστικό τα παρατεταμένα υψηλά επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Ο ΣΔ αποτελεί νόσο που αντιμετωπίζει μεγάλο ποσοστό του πληθυσμού. Σύμφωνα με τα στοιχεία του παγκόσμιου οργανισμού υγείας, το 2022, το ποσοστό των ασθενών έφτανε στο 14% του παγκόσμιου πληθυσμού. Οι δύο κύριοι τύποι ΣΔ είναι ο τύπος 1 (ΣΔ1) ή αλλιώς ινσουλινοεξαρτώμενος, και ο τύπος 2 (ΣΔ2), με τον δεύτερο τύπο να επικρατεί (90-95% των περιπτώσεων έχουν ΣΔ2). Ο ΣΔ1 είναι αυτοάνοσης αιτιολογίας, ενώ οι παράγοντες κινδύνου για τον ΣΔ2 περιλαμβάνουν έναν σύνθετο συνδυασμό γενετικών, μεταβολικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, με κύριο χαρακτηριστικό της νόσου την αντίσταση στην ινσουλίνη. Για την φαρμακευτική αντιμετώπιση του ΣΔ2 έχουν εγκριθεί διάφορες κατηγορίες φαρμάκων με αντίστοιχους φαρμακευτικούς στόχους . Σε αυτά εντάσσονται φάρμακα που αυξάνουν την έκκριση ινσουλίνης (σουλφονυλουρίες), φάρμακα που βελτιώνουν την αντίσταση στην ινσουλίνη (διγουανίδια και θειαζολιδινδιόνες), φάρμακα που μειώνουν την εντερική απορρόφηση γλυκόζης (αναστολείς α-γλυκοσιδάσης και α-αμυλάσης), φάρμακα που δρουν μέσω των ινκρετινών (αναστολείς DPP4 και αγωνιστές υποδοχέων GLP-1 και GIP) και φάρμακα που αυξάνουν την απέκκριση γλυκόζης από τους νεφρούς (αναστολείς SGLT2). Επίσης υπάρχουν και νέοι φαρμακευτικοί στόχοι για τους οποίους δεν έχουν εγκριθεί ακόμα φάρμακα, όπως οι αναστολείς PTP1b (βελτιώνουν την αντίσταση στην ινσουλίνη), ενεργοποιητές γλυκοκινάσης και νέες προσεγγίσεις για την αναγέννηση/ πολλαπλασιασμό των β-κυττάρων. Παράλληλα με την παραγωγή νέων συνθετικών ενώσεων, έχει γίνει εκτενής μελέτη συστατικών που προέρχονται από φαρμακευτικά φυτά για πιθανή αντι-διαβητική δράση. Από τους υπάρχοντες φαρμακευτικούς στόχους στην παρούσα Διδακτορική διατριβή δίνεται έμφαση στην DPP4 και την PTP1b. Η DPP4 είναι μια πρωτεΐνη που δρα είτε σαν υποδοχέας στην επιφάνεια των κυττάρων είτε σαν πεπτιδάση σερίνης. Ως ένζυμο έχει πολλά υποστρώματα για αυτό μελετάται για τη συμβολή της σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Επιπλέον έχει ήδη αναφερθεί ότι υπάρχουν πολλές ισομορφές του ενζύμου λόγω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων όπως Ο- και Ν- γλυκοζυλίωση. Η DPP4 αποτελεί φαρμακευτικό στόχο για τον ΣΔ2, καθώς δύο από τα κύρια υποστρώματα της, οι ινκρετίνες GLP-1 και GIP είναι ορμόνες του γαστρεντερικού συστήματος που διεγείρουν την έκκριση ινσουλίνης μετά από πρόσληψη γλυκόζης. Η αλληλεπίδρασή τους με τους αντίστοιχους υποδοχείς διεγείρει την έκκριση ινσουλίνης ανάλογα με τα επίπεδα γλυκόζη και παράλληλα αναστέλλει την δράση της γλυκαγόνης. Επιπλέον η GLP-1 και λιγότερο η GIP επιβραδύνει τη γαστρική κένωση και μειώνει την όρεξη. Παράλληλα, τόσο η GLP-1 όσο και η GIP προάγουν τη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό των β-κυττάρων του παγκρέατος, ενισχύοντας την επιβίωση και τη λειτουργικότητα αυτών των κυττάρων και μειώνοντας την απόπτωση. Ο φυσιολογικός χρόνος ημιζωής της GLP-1 και της GIP είναι μικρός, καθώς και οι δύο αδρανοποιούνται γρήγορα από το ένζυμο DPP4. Συνεπώς, η αναστολή της δράσης της DPP4 αυξάνει τον χρόνο ημιζωής των ινκρετινών και ως αποτέλεσμα τον χρόνο δράσης τους. Υπάρχουν ήδη εγκεκριμένοι αναστολείς της DPP4, με συναγωνιστικό τύπο αναστολής, με μερικούς εκ των οποίων να σχηματίζουν ομοιοπολικό δεσμό με το ένζυμο. Η PTP1b είναι μια φωσφατάση πρωτεϊνών τυροσίνης που εμπλέκεται στην απενεργοποίηση του υποδοχέα της ινσουλίνης. Συγκεκριμένα μετά την αλληλεπίδραση της ινσουλίνης με τον υποδοχέα της, το ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα που έχει δράση κινάσης αυτοφωσφορυλιώνεται και μέσω ενδοκυττάριων διεργασιών επάγεται η μεταφορά των κυστιδίων αποθήκευσης μεταφορέων γλυκόζης GLUT4 στην επιφάνεια των κυττάρων και επιτρέποντας την εισαγωγή της γλυκόζης στο κύτταρο. Η PTP1b αποφωσφορυλιώνει το ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα και τον απενεργοποιεί με συνέπεια να διακόπτεται η εισαγωγή γλυκόζης στο κύτταρο. Συνεπώς, η αναστολή της PTP1b οδηγεί στην παρατεταμένη εισαγωγή γλυκόζης στο κύτταρο και την πτώση των επιπέδων γλυκόζης στην κυκλοφορία. Επειδή η φωσφατάσες πρωτεϊνών τυροσίνης έχουν μεγάλη ομολογία στο ενεργό κέντρο, η διερεύνηση αναστολέων για την PTP1b έχει στραφεί σε αλλοστερικούς αναστολείς. Ωστόσο δεν υπάρχει κάποιος εγκεκριμένος αναστολέας PTP1b, καθώς οι περισσότεροι που μελετήθηκαν σταμάτησαν σε κάποιο στάδιο κλινικών μελετών είτε λόγο χαμηλής δράσης είτε λόγο εμφάνισης σημαντικών παρενεργειών. Σκοπός την παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η εύρεση νέων αναστολέων των ενζύμων DPP4 και PTP1b που αποτελούν φαρμακευτικούς στόχους για την αντιμετώπιση του Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου 2. Πιο αναλυτικά οι βασική στόχοι της διατριβής ήταν: α) η εύρεση νέων αναστολέων με μη ομοιοπολική σύνδεση και στόχευση κατά προτίμηση σε αλλοστερικά κέντρα των ενζύμων με σκοπό την αυξημένη αποτελεσματικότητα με ταυτόχρονη μείωση των παρενεργειών. Β) η εύρεση αναστολέων διπλής δράσης έναντι των ενζύμων DPP4 και PTP1b γ) ο εντοπισμός διαφοροποιήσεων των ισομορφών της DPP4 σε ορούς ασθενών με ΣΔ2 σε σχέση με τους υγιείς και ασθενείς με άλλες παθολογικές καταστάσεις συσχετιζόμενες με την δράση της DPP4, με στόχο τη δοκιμασία νέων αναστολέων στις ισομορφές που επικρατούν είτε σε ισομορφές που παρατηρούνται μόνο στον ΣΔ2. Στους επιμέρους στόχους της διατριβής ήταν η βελτίωση του μοντέλου/στρατηγικής πρόβλεψης της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων που εφαρμόζεται πριν τα in vitro πειράματα προκειμένου να επιλεγούν οι περισσότερο υποσχόμενες ενώσεις. Η πρόβλεψη γίνεται με την μέθοδο εκτίμησης δημιουργίας σταθερού συμπλόκου (Docking Analysis). Για να επιτευχθεί η εύρεση ισχυρών αναστολέων αρχικά έγινε μελέτη πρόβλεψης για με την μέθοδο docking με στόχευση στο ενεργό κέντρο των δύο ενζύμων και στο σύνολο του ενζύμου και στη περίπτωση της PTP1b και στο αλλοστερικό κέντρο (καθορισμένο από κρυσταλλοφραφικές μελέτες). Οι ενώσεις με καλή πρόβλεψη μελετήθηκαν in vitro για την ανασταλτική τους ικανότητα έναντι της DPP4 και της PTP1b. Επιπλέον, έγινε έλεγχος του τύπου αναστολής με στόχο την εύρεση αλλοστερικών αναστολέων. Και για τα δύο ένζυμα μελετήθηκαν δεκαέξι παράγωγα της 3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλ)-2-αρυλοθειαζολιδιν-4-όνης και δεκαεννιά ενώσεις φυτικής προέλευσης, από τις οποίες οκτώ απομονώθηκαν από το φυτό Thymus thracicus Velen και έντεκα από το φυτό Centaurea bruguieriana subsp. Belangeriana. Για την εκτίμηση του τύπου αναστολής προσδιορίστηκε η δράση των αναστολέων σε δύο συγκεντρώσεις υποστρώματος. Στην περίπτωση της DPP4 έγινε πιο εκτενής έλεγχος της δράσης των αναστολέων σε περισσότερες συγκεντρώσεις υποστρώματος και καθορίστηκαν οι μεταβολές τις Km και της Vmax με χρήση διαγραμμάτων Lineweaver-Burk. Για την επίτευξη καλύτερου μοντέλου πρόβλεψης από τα αποτελέσματα πρόβλεψης και in vitro δράσης των συνθετικών ενώσεων δημιουργήθηκε ένα μοντέλο καλύτερης πρόβλεψης το οποίο εφαρμόστηκε και επιβεβαιώθηκε με τις φυτικές ενώσεις για τους συναγωνιστικούς αναστολείς τις DPP4 και σχετικά καλή εφαρμογή και στους άλλους τύπους. Για την εύρεση διαφοροποιήσεων των ισομορφών της DPP4 σε ορούς ασθενών με ΣΔ2 σε σχέση με τους υγιείς ασθενείς με άλλες παθολογικές καταστάσεις συσχετιζόμενες με την δράση της DPP4 πραγματοποιήθηκαν ηλεκτροφορήσεις απουσία μετουσιωτικών παραγόντων (native) και SDS ηλεκτροφορήσεις σε ορούς υγιών και ασθενών είτε με ΣΔ2 είτε άλλων παθήσεων. Στην συνέχεια έγινε ηλεκτρομεταφορά και ανίχνευση με ειδικό αντίσωμα έναντι της DPP4 (Western blot/Immunoblot). Επιπλέον, για τον διαχωρισμό και την απομόνωση των ισομορφών πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία στήλης ιονικής ανταλλαγής (στήλη DEAE) και ανίχνευση ενζυμικής δράσης. Στα κλάσματα με υψηλή ενζυμική δράσης και στα κλάσματα που ανιχνεύτηκε αυξημένη δράση στους ασθενείς με ΣΔ2 πραγματοποιήθηκαν SDS ηλεκτροφορήσεις, ώστε να μελετηθεί και το μοριακό βάρος αυτών των ισομορφών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των συνθετικών ενώσεων, αναστολή έναντι της DPP4 παρατηρήθηκε σε δώδεκα από τα δεκαέξι παράγωγα της 3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλ)-2-αρυλ-θειαζολιδιν-4-όνης με τιμές IC50 στην περιοχή των nM. Οι συνθετικές ενώσεις που ελέγχθηκαν και εμφάνισαν IC50 στην περιοχή των nM ανήκουν δομικά σε δύο κατηγορίες: παράγωγα που φέρουν τμήμα 6-OCF3-βενζο[d]θειαζολ-2-υλίου (ενώσεις h) και παράγωγα που φέρουν τμήμα 6-Ad-βενζο[d]θειαζολ-2-υλίου (ένωση m2) ή 4-CH3-6 -Ad-βενζο[d]θειαζολ-2-υλίου (ενώσεις n). Η υποκατάσταση της ομάδας του βενζο[d]θειαζολ-2-υλίου έχει τη μεγαλύτερη επίδραση στην ανασταλτική δράση, με τα παράγωγα 6-OCF3 (h) να είναι πιο ισχυροί αναστολείς από τα 6-Ad (m2) και 4-CH3, 6-Ad (n1/2) παράγωγα, εμφανίζοντας IC50 στην περιοχή των nM. Όλα τα 6-Cl παράγωγα (c) εμφάνισαν τιμές IC50 στην περιοχή των μM. Οι ενώσεις της κατηγορίας h εμφάνισαν ισχυρότερη αναστολή, σε σύγκριση με τους εγκεκριμένους αναστολείς. Πέντε ενώσεις της κατηγορίας h (h1 , h3 , h4 , h5 και h7) εμφάνισαν χαμηλότερες τιμές IC50 από τη Vildagliptin (IC50 : 62 nM) και τη Saxagliptin (IC50 : 50 nM), δύο χαμηλότερες (h3 και h5) από την Alogliptin (IC50 : 24 nM) και μία, η 3-(6-OCF3-βενζο [d]θειαζολ-2-υλ)-2-(2,6-2F-φαινυλθειαζολιδιν-4-όνη (h3) χαμηλότερη από τη Sitagliptin (IC50 : 20 nM). Τέσσερις από τις ενώσεις (h3,h4,n2,c2) εμφάνισαν συναγωνιστικό (competitive) τύπο αναστολής, δύο (m2,c4) ανταγωνιστικό (uncompetitive), μια (n1) μη συναγωνιστικό (non-competitive) και μία (h9) μεικτό τύπο αναστολής.

Από τις φυτικές ενώσεις που ελέγχθηκαν, 3 ενώσεις του φυτού Thymus thracicus Velen έδειξαν χαρακτηριστικά συναγωνιστικής αναστολής ως προς την DPP4 (RTH-DE, RTH14-2, RTH-5-2), ενώ 2 (RTH-DJ και BBC-FCH) εμφάνισαν μεικτή αναστολή και δύο ενώσεις εμφάνισαν μη συναγωνιστική αναστολή (RTH-EJ και RTH-ED). Από τις ενώσεις του φυτού Centaurea bruguieriana subsp. Belangeriana 3 (CEP-IMI, CEP-IMK και CEP-GG) εμφάνισαν αναστολή έναντι της DPP4, με τις 2 από αυτές (CEP-GG και CEP-IMI) να εμφανίζουν ανταγωνιστική αναστολή. Οι IC50 όλων των φυτικών ενώσεων έναντι της DPP4 βρίσκονταν στην κλίμακα των μΜ.

Όσον αφορά την PTP1b από τα δεκαέξι παράγωγα της 3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλ)-2-αρυλ θειαζολιδιν-4-όνης, εφτά εμφάνισαν καλά αποτελέσματα αναστολής στο επίπεδο των μΜ. Οι ενώσεις με υποκαταστάτη 6-OCF3 στην ομάδα βενζο[d]θειαζολ-2-υλίου εμφάνισαν χαρακτηριστικά μη συναγωνιστικής ή ανταγωνιστικής αναστολής, ενώ η ένωση με υποκαταστάτη 4-CH3, 6-Ad (n2) εμφάνισε χαρακτηριστικά συναγωνιστικής (competitive) αναστολής και την υψηλότερη ισχύ ως αναστολέας της PTP1b. Από τις ενώσεις του φυτού Thymus thracicus Velen τέσσερις εμφάνισαν IC50 από 18,4 ± 1,7 έως 25,7 ± 1,8 μΜ, μία 58,9 ± 7,0 και δύο εμφάνισαν χαμηλότερη ισχύ με τιμές IC50 80,8 ± 3,8 και 90,7 ± 0,9μΜ. Οι τρεις ουσίες με την πιο υψηλή ισχύ αναστολέα της PTP1b ήταν κατά φθίνουσα σειρά: η 2(3,4-διυδροξυ) φαινυλαιθυλ-γλυκοπυρανοσίδη με ακολουθούμενη από την Καλσεολαρισίδη A και ο 9″- λιθοσπερμικός μεθυλεστέρας. Από το φυτό C. Bruguieriana subsp. Belamgeriana, οι τρεις ουσίες που εμφάνισαν υψηλή ισχύ ως αναστολείς της PTP1b ήταν με φθίνουσα σειρά οι ουσίες: 3-O-β-D-γλυκοπυρανοσίδης της 6-μεθοξυκαιμπφερόλης, ακολουθούμενη από την αστραγαλίνη και τo Μαλασιτανολίδιο με IC50 33,4 ± 8,2, 30,9 ± 4,8μΜ και 117,8 ±14,2 μΜ, αντίστοιχα. Συμπερασματικά, έξι από τις συνθετικές ενώσεις, παράγωγα της 3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλ)-2-αρυλοθειαζολιδιν-4-όνης, έδειξαν διπλή δράση αναστολής έναντι της DPP4 και PTP1b. Εξ αυτών μία ένωση, η h9, έδειξε διπλή δράση αναστολέα με τύπο αναστολής διαφορετικό από τον συναγωνιστικό και ως προς τα δύο ένζυμα, παρουσιάζοντας μεικτή αναστολή ως προς την DPP4 και ανταγωνιστική αναστολή ως προς την PTP1b και IC50 στην περιοχή των nM για την DPP4 και μΜ για την PTP1b. Από τις φυτικές ενώσεις 6 ενώσεις από το φυτό Thymus thracicus Velen και 2 από το φυτό Centaurea bruguieriana subsp. Belangeriana έδειξαν διπλή δράση αναστολής έναντι τόσο της DPP4 όσο και της PTP1b. Έξι από τις ενώσεις διπλής δράσης φαίνεται να εμφανίζουν χαρακτηριστικά άλλου τύπου αναστολής, πλην της συναγωνιστικής, συνδεόμενοι κατά συνέπεια με κάποιο αλλοστερικό κέντρο. Για την εύρεση διαφοροποιήσεων των μορφών DPP4 σε ορούς ασθενών με ΣΔ2 σε σχέση με των υγιών, τα αποτελέσματα μετά από ηλεκτροφόρηση, ηλεκτρομεταφορά και ανίχνευση με ειδικό αντίσωμα, έδειξαν ότι στον ορό των ασθενών με ΣΔ2 υπάρχουν ισομορφές που διαφέρουν από των υγιών τόσο στο ισοηλεκτρικό σημείο όσο και στο μοριακό βάρος. Επιπλέον με την μελέτη ορών από άλλες παθολογικές καταστάσεις με τις οποίες συσχετίζεται η δράση της DPP4 (νόσος Alzheimer και τύποι καρκίνου) φάνηκε ότι στις διάφορες παθολογικές καταστάσεις δεν ανευρίσκονται οι ίδιες διαφοροποιήσεις των ισομορφών της DPP4. Στους ασθενείς με ΣΔ2 ανιχνεύθηκαν ισομορφές με μεγαλύτερο εύρος ισοηλεκτρικών σημείων σε σχέση με τους υγιείς και διαφοροποίηση του ηλεκτροφορητικού προφίλ διαχωρισμού με στήλη DEAE που στηρίζεται στην διαφορά ισοηλεκτρικού σημείου. Παρατηρήθηκε διαφοροποίηση ισομορφών μεταξύ ασθενών με ΣΔ2 και ασθενών με ΣΔ1 και προ-Διαβήτη. Επιπλέον, παρατηρήθηκε διαφορά στις ισομορφές της DPP4 σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα με σαφώς διαφορετικό ηλεκτροφορητικό προφίλ σε συγκεκριμένες ηλεκτροφορητικές συνθήκες απουσία μετουσιωτικών παραγόντων σε σύγκριση με τους υγιείς και ασθενείς με άλλες παθολογικές καταστάσεις. Ανάλογα, εντοπίστηκε διαφορά στις ισομορφές της DPP4 σε ασθενείς με Alzheimer σε σύγκριση με τους υγιείς και ασθενείς με άλλες παθολογικές καταστάσεις ενώ χαρακτηριστική ήταν η εμφάνιση ισομορφών της DPP4 με μεγάλα μοριακά βάρη στον ορό ασθενών με ΣΔ2 και Alzheimer με περισσότερες και υψηλότερου Μοριακού Βάρους ζώνες να παρατηρούνται στους ασθενείς με Alzheimer. Ο διαχωρισμός με στήλη ανιονικής ανταλλαγής (DEAE) και ανίχνευση ενζυμικής δράσης της DPP4 στα κλάσματα έκλουσης έδειξε διαφορές των υγειών και των ασθενών με διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Οι παρατηρούμενες διαφορές μπορούν να έχουν εφαρμογή στην μελέτη της παθοφυσιολογίας των νόσων, στην διαγνωστική και την θεραπευτική αντιμετώπισή τους. Μετά τον μερικό διαχωρισμό των ισομορφών της DPP4 με την χρωματογραφία στήλης δοκιμάστηκαν τέσσερις από τους συνθετικούς αναστολείς (h3, m2, n1 και h8) για την ανασταλτική δράση τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μελετώμενοι αναστολείς δεν είχαν την ίδια ισχύ σε όλες τις ισομορφές σε αντίθεση με την Sitasgliptin. Επιπλέον τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η h3 που εμφάνισε χαρακτηριστικά συναγωνιστικού αναστολέα στο ανασυνδιασμένο ένζυμο εμφάνισε τον ίδιο τύπο αναστολής σε όλες τις διαχωρισμένες ισομορφές, ωστόσο μεγαλύτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι υπόλοιπες ενώσεις που είχαν διαφορετικό τύπο αναστολής. Οι αναστολείς n1 και m2 έδειξαν ότι σε διαφορετικούς τύπους ισομορφών όχι μόνο έχουν διαφορετική ισχύ αλλά και διαφορετικό τρόπο δράσης. Τέλος τόσο η Sitagliptin όσο και οι νέοι αναστολείς έδειξαν χαμηλότερή ισχύ στις απομονωμένες ισομορφές από ορό υγιούς, με τα παράγωγα 3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλ)-2-αρυλοθειαζολιδιν-4-όνης να δείχνουν σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά αναστολής. Από τη μελέτη επιλεγμένων αναστολέων στις μερικώς απομονωμένες ισομορφές φάνηκε ότι παράγωγα 3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλ)-2-αρυλοθειαζολιδιν-4-όνης κυρίως με άλλου τύπου αναστολή πέρα της συναγωνιστικής θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως αναστολείς συγκεκριμένων ισομορφών γεγονός που θα μπορούσε να οδηγήσει σε φάρμακα με λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες. Ενδεικτικό έλεγχος τοξικότητας σε συνθετικές και φυσικές ενώσεις έδειξε ενθαρρυντικά αποτελέσματα ιδιαίτερα για τις ενώσεις που συγκεντρώνουν σημαντικά επιθυμητά χαρακτηριστικά. Στα πλαίσια των παράλληλων στόχων της διατριβής, δημιουργήθηκε και ελέγχθηκε με θετικά αποτελέσματα παράγοντας πιθανότητας (Probability Factor, PF) που συνδυάζει στοιχεία από τα αποτελέσματα της υπολογιστικής μελέτης πρόσδεσης (Docking) με στόχευση σε συγκεκριμένη περιοχή (ενεργό ή αλλοστερικό κέντρο) και της μελέτης στόχευσης στο σύνολο του ενζύμου, προκειμένου να προβλεφθεί αποτελεσματικά η IC50 νέων πιθανών αναστολέων.Diabetes Mellitus (DM) is a multifactorial metabolic disease, characterized primarily by prolonged elevated blood glucose levels. DM affects a large percentage of the population. According to data from the World Health Organization, in 2022, the percentage of patients reached 14% of the global population. The two main types of DM are type 1 (DM1), also known as insulin-dependent, and type 2 (DM2), with the second being predominant (90–95% of cases are DM2). DM1 has an autoimmune etiology, whereas the risk factors for DM2 include a complex combination of genetic, metabolic, and environmental factors, with insulin resistance being the hallmark of the disease. For the pharmacological management of DM2, various classes of drugs with corresponding therapeutic targets have been approved. These include drugs that increase insulin secretion (sulfonylureas), drugs that improve insulin resistance (biguanides and thiazolidinediones), drugs that decrease intestinal glucose absorption (α-glucosidase and α-amylase inhibitors), drugs acting via incretins (DPP4 inhibitors and GLP-1 and GIP receptor agonists), and drugs that increase renal glucose excretion (SGLT2 inhibitors). There are also new pharmacological targets for which no drugs have been approved yet, such as PTP1b inhibitors (improving insulin resistance), glucokinase activators, and new approaches for β-cell regeneration/proliferation. Alongside the development of new synthetic compounds, extensive research has been conducted on constituents derived from medicinal plants for potential anti-diabetic activity. Among the existing pharmacological targets, this PhD thesis focuses on DPP4 and PTP1b. DPP4 is a protein that acts either as a receptor on the cell surface or as a serine peptidase. As an enzyme, it has many substrates and is studied for its role in several pathological conditions. Many isoforms of the enzyme have been reported due to post-translational modifications such as O- and N-glycosylation. DPP4 is a pharmacological target for DM2 because two of its main substrates, the incretins GLP-1 and GIP, are gastrointestinal hormones that stimulate insulin secretion after glucose intake. Their interaction with their respective receptors stimulates insulin secretion depending on glucose levels while simultaneously inhibiting glucagon action. In addition, GLP-1 and GIP decrease gastric emptying and reduce appetite. Both GLP-1 and GIP also promote pancreatic β-cell viability and proliferation, enhancing survival and function while reducing apoptosis. Their physiological half-life is short because both are rapidly inactivated by DPP4. Therefore, inhibition of DPP4 increases the half-life of incretins and consequently duration of their action. There are already approved DPP4 inhibitors, all exhibiting competitive inhibition, whith some of them forming covalent bonds with the enzyme. PTP1b is a protein tyrosine phosphatase involved in the deactivation of the insulin receptor. Specifically, following insulin binding to its receptor, the intracellular domain of the receptor (with kinase activity) is activated by autophosphorylation and triggers intracellular processes that induce the translocation of GLUT4-containing vesicles to the cell surface, allowing glucose entry into the cell. PTP1b dephosphorylates the intracellular portion of the receptor, thereby deactivating it and stopping glucose entry. Thus, inhibition of PTP1b leads to prolonged glucose uptake into the cell and decreased blood glucose levels. Since protein tyrosine phosphatases have high homology at their active sites, research on PTP1b inhibitors has shifted toward allosteric inhibitors. However, no PTP1b inhibitors have been approved, as most compounds have failed at various clinical stages due to low activity or significant side effects. The aim of this PhD thesis was to identify new inhibitors of the enzymes DPP4 and PTP1b, which are pharmacological targets for the treatment of type II Diabetes Mellitus. More specifically, the primary objectives were: (a) the discovery of novel inhibitors with non-covalent binding, preferably targeting allosteric sites to enhance efficacy while reducing side effects; (b) the identification of dual-acting inhibitors against both DPP4 and PTP1b; (c) the detection of variations in DPP4 isoforms in sera from DM2 patients compared to healthy individuals and patients with other DPP4-related pathological conditions, with the aim of testing new inhibitors on the dominant or DM2-specific isoforms. A secondary objective was improving the computational model/strategy for prediction of inhibitory activity prior to in vitro testing, to better select the most promising compounds. Prediction processs involved an estimation of stable complex formation (docking analysis). To identify strong inhibitors, docking prediction studies were performed initially targeted to the active site of both enzymes, to the entire enzyme structure, and, for PTP1b, also to the allosteric site (previously defined by crystallographic studies). Compounds with good predicted activity were then studied in vitro for inhibitory potential against DPP4 and PTP1b. Additionally, the type of inhibition was assessed to identify allosteric inhibitors. Sixteen derivatives of 3-(benzothiazol-2-yl)-2-aryl-thiazolidin-4-one and nineteen plant-derived compounds were studied—eight isolated from Thymus thracicus Velen and eleven from Centaurea bruguieriana subsp. belangeriana. To determine the type of inhibition, the inhibitors’ activity was assessed at two substrate concentrations. For DPP4, a more extensive evaluation was performed using multiple substrate concentrations, and Km and Vmax changes were calculated via Lineweaver–Burk plots. Using the computational predictions and in vitro results for the synthetic compounds, an improved prediction model was developed and validated using plant compounds for competitive DPP4 inhibitors also showing reasonable applicability for the other inhibition types. To identify DPP4 isoform differences in sera from DM2 patients compared to healthy individuals and patients with DPP4-related conditions, both native and SDS electrophoresis were performed, followed by Western blot analysis using a DPP4-specific antibody. Additionally, ion-exchange chromatography (DEAE column) was used for separation and isolation of isoforms, and enzymatic activity was measured. Fractions with high enzymatic activity, or overexpressed in DM2 patients, underwent SDS electrophoresis to assess molecular weight. According to the results, twelve of the sixteen 3-(benzothiazol-2-yl)-2-aryl-thiazolidin-4-one derivatives showed DPP4 inhibition, with IC50 values in the nM range. The synthetic compounds belonged to three structural categories: derivatives containing a 6-OCF3-benzothiazol-2-yl moiety (h series) derivatives with 6-Ad-benzothiazol-2-yl (m2) or 4-CH3-6-Ad-benzothiazol-2-yl (n/m series) and 6-Cl derivatives (c series). Substitution on the benzothiazol-2-yl group had the greatest effect on inhibitory activity, with 6-OCF3 derivatives (h) being more potent than 6-Ad (m2) and 4-CH3,6-Ad (n1/2) derivatives, exhibiting IC50 values in the nM range. All 6-Cl derivatives (c series) had IC50 values in the μM range. Compounds in the h series were stronger inhibitors than approved drugs. Five of them (h1, h3, h4, h5, h7) had lower IC50 values than Vildagliptin (62 nM) and Saxagliptin (50 nM), two (h3 and h5) had lower IC50 than Alogliptin (24 nM), and one compound 3-(6-OCF3-benzothiazol-2-yl)-2-(2,6-2F-phenylthiazolidin-4-one) (h3) had a lower IC50 than Sitagliptin (20 nM). Four compounds (h3, h4, n2, c2) exhibited competitive inhibition, two (m2, c4) uncompetitive, one (n1) non-competitive, and one (h9) mixed-type inhibition. Among plant compounds, three from Thymus thracicus Velen showed competitive inhibition of DPP4 (RTH-DE, RTH14-2, RTH-5-2), two (RTH-DJ and BBC-FCH) showed mixed inhibition, and two showed non-competitive inhibition (RTH-EJ and RTH-ED). From Centaurea bruguieriana subsp. belangeriana, three compounds inhibited DPP4 (CEP-IMI, CEP-IMK and CEP-GG), with two (CEP-GG and CEP-IMI) displaying uncompetitive inhibition. All plant inhibitors had IC50 values in the μM range. For PTP1b, seven of the sixteen synthetic derivatives showed good inhibitory activity in the μM range. Compounds with a 6-OCF3 substituent on the benzothiazol-2-yl group showed non-competitive or uncompetitive inhibition, while the 4-CH3, 6-Ad derivative (n2) exhibited competitive inhibition and the highest potency. Concerning Thymus thracicus Velen, four compounds had IC50 values from 18.4 ± 1.7 to 25.7 ± 1.8 μM, one had 58.9 ± 7.0 μM, and two showed lower potency with IC50 values of 80.8 ± 3.8 and 90.7 ± 0.9 μM. The three most potent inhibitors, in descending order, were: – 2(3,4-dihydroxy)phenylethyl-glucopyranoside – calceolarioside A – 9”-methyl lithospermic acid.

The most potent inhibitors from Centaurea bruguieriana, were: – 6-methoxykaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside – astragalin – malacitanolide, with IC50 values of 33.4 ± 8.2, 30.9 ± 4.8, and 117.8 ± 14.2 μM, respectively. In summary, six synthetic 3-(benzothiazol-2-yl)-2-aryl-thiazolidin-4-one derivatives exhibited dual inhibitory activity against both DPP4 and PTP1b. Among them, compound h9 showed dual action with mixed/uncompetitive-type inhibition, having nM-range IC50 for DPP4 and μM-range IC50 for PTP1b. Conserning plant compounds, six from Thymus thracicus and two from Centaurea bruguieriana exhibited dual inhibition. Six of these showed non-competitive, uncompetitive or mixed inhibition, suggesting allosteric binding. Analysis of DPP4 isoforms showed differences between DM2 patients and healthy individuals in isoelectric point and molecular weight. Studies of other pathological conditions (Alzheimer’s disease, cancer types) showed distinct DPP4 isoform profiles. DM2 patients showed a broader range of isoelectric points and altered DEAE-column separation profiles. Differences were also observed between DM2, DM1, and pre-diabetes patients. Notably, patients with lung adenocarcinoma exhibited clearly distinct DPP4 isoforms under non-denaturing electrophoretic conditions, while Alzheimer’s patients exhibited additional high-molecular-weight DPP4 isoforms.

DEAE-column fractionation and enzymatic activity assays showed differences in elution profiles across patient groups. These differences may have applications in studying disease pathophysiology, diagnostics, and therapeutic strategies. After partial separation of DPP4 isoforms, four synthetic inhibitors (h3, m2, n1, h8) were tested. Results showed that the inhibitors did not have equal potency across isoforms, unlike Sitagliptin. Compound h3 remained competitive across all isoforms, whereas m2 and n1 showed different inhibitory modes depending on the isoform. Both Sitagliptin and the new inhibitors showed reduced potency on isoforms isolated from healthy serum, with the thiazolidinone derivatives displaying significantly reduced inhibition. The study suggests that non-competitive or mixed-type thiazolidinone derivatives could serve as isoform-specific DPP4 inhibitors, potentially leading to drugs with fewer adverse effects. Preliminary toxicity testing of synthetic and natural compounds showed encouraging results, particularly for those with the most promising characteristics. Finally, a Probability Factor (PF) was developed and validated, combining data from targeted docking studies (towards active or allosteric sites) and whole-enzyme docking to effectively predict IC50 values of new potential inhibitors.